结核病实验室诊断的进展及挑战
引用:吴小翠,余方友.结核病实验室诊断的进展及挑战[J].中华传染病杂志,2021,39(10):591-597.
19世纪，被称为"白色瘟疫"的结核病在欧洲和北美洲大肆流行，成为导致人类死亡的主要原因。随着抗菌药物、卡介苗和化学治疗药物的问世，结核病的发病率和病死率大幅降低。20世纪80年代末，由于HIV感染和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)耐药菌株的出现，使结核病成为严重的公共卫生和社会问题。目前，由MTB感染引起的结核病仍为重要传染病，是全球十大死亡原因之一。WHO报告显示，2019年全球结核病新发病例约为1 000万例，死亡病例为140万例，新增利福平耐药结核病(rifampicin resistant tuberculosis，RRTB)近50万例，其中78%为耐多药结核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)。我国是结核病高负担国家，仅次于印度和印度尼西亚，2019年全年新增结核病患者83.3万例；据估计，我国2019年新增MDR-TB/RRTB患者约6.5万例。
WHO于2014年提出"终止结核病策略"，其主要目标是：与2015年相比，至2035年实现结核病发病率下降90%及病死率下降95%；且无因结核病对家庭造成灾难性支出的情况。但目前要实现这一目标还有很大困难。全球范围内，从2015年至2019年结核病的发病率仅下降9%，未完成至2020年结核病发病率下降20%的里程碑目标。为了实现这一目标，及时、准确地检测MTB对结核病的治疗和预防至关重要，故有必要加快推动结核病实验室诊断技术的发展，特别是一些新技术的应用。本研究从MTB的菌种鉴定、药物敏感性检测、免疫学诊断方法，以及各种组学用于结核病诊断的进展等方面予以述评。
一、分枝杆菌菌种鉴定的进展
(一)荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridization，FISH)
FISH是一种重要的非放射性原位杂交技术，可对DNA进行定性、定量或相对定位分析。研究显示，FISH可用于检测痰样本中结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)，其测定的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为76.4%、99.6%、95.6%和97.6%；另有研究显示，FISH可区分MTBC和非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，且具有较好的诊断价值。总体而言，FISH的结果直观，且不需要在分子生物学实验室操作，适用于资源有限地区的分枝杆菌鉴定，但该技术的灵敏度仍有待改善。
(二)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)
MALDI-TOF-MS是近年来临床微生物鉴定领域运用较为广泛的技术。研究显示，MALDI-TOF-MS可对分枝杆菌培养物进行菌种鉴定，其结果快速、准确且成本低。Luo等使用MALDI-TOF-MS正确鉴定了93.9%(476/507)的分枝杆菌分离株，4.5%(23/507)无鉴定结果，1.6%(8/507)被错误鉴定。MALDI-TOF-MS在分枝杆菌的菌种鉴定上具有较好的应用前景，特别是在配备有MALDI-TOF-MS的实验室，其成本低，检测速度快，但仍存在一定缺陷，如其鉴定能力依赖于样本数据库，还需要培养后的菌株用于鉴定。另外，由于MTB属于传染性较强的病原菌，实验室应用MALDI-TOF-MS进行菌种鉴定时的生物安全防护也非常重要。
(三)分子生物学方法
目前，常用于分枝杆菌菌种鉴定的靶基因有IS6110插入序列、16S rRNA、16S-23S rRNA基因内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)、热休克蛋白65(heat shock protein 65，hsp65)基因、rpoB基因等。合适的基因标识是分子生物学进行分枝杆菌菌种鉴定的关键。
1．实时荧光PCR：
目前，临床上常用的MTB实时荧光PCR检测试剂盒多以IS6110作为分子靶标。IS6110可区分MTBC和NTM，但不能用于NTM的菌种鉴定。目前，临床运用非常广泛的GeneXpert MTB/RIF(美国赛沛公司)是一种以半巢式实时定量PCR为技术基础，同时检测MTB和利福平耐药的方法，操作简便，结果报告时间短，但其灵敏度有待提高。第2代试剂Xpert MTB/RIF Ultra是2017年WHO推荐使用的新一代检测方法，可用来替代GeneXpert MTB/RIF。Xpert MTB/RIF Ultra增加检测多拷贝MTB靶标IS6110和IS1081，其灵敏性较GeneXpert MTB/RIF大大提高，但特异性略有降低，而两者检测利福平耐药的性能相似。Truenat™ MTB、MTB Plus和MTB-RIF Dx(印度Molbio Diagnostics公司)是一种新型的基于芯片的微实时PCR检测方法，可在1 h内直接从痰液中获取MTBC检测结果和利福平耐药结果。研究证实，Truenat™ MTB、MTB Plus和MTB-RIF Dx检测MTBC的特异度与GeneXpert MTB/RIF、Xpert MTB/RIF Ultra相似，但灵敏度略低。2020年，WHO发布的整合版结核病指南第3模块显示：关于结核病快速诊断的初始检测分子诊断方法，推荐GeneXpert MTB/RIF，Xpert MTB/RIF Ultra，Truenat™ MTB、MTB Plus和MTB-RIF Dx用于结核病初筛测试。笔者认为，实时荧光PCR方法在结核病的初筛中有重要应用价值，且在一般PCR实验室即可开展，易于推广。
2．聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis，PRA)：
通过PCR扩增靶基因序列，再将产物酶切进行电泳，而后检测获得酶切指纹图谱，从而鉴定菌种。常用的分子标识主要是16S-23S rRNA、hsp65、IS6110和rpoB，多项研究显示该方法简便，成本低，适用于分枝杆菌菌种的鉴定。近年来，该方法的研究越来越少，可能是由于该技术本身存在的一些局限性，新发现的分枝杆菌菌种或亚种的相应酶切图谱尚未补充，所以限制了该技术的运用。同时，酶切图谱的识别多为人工判断，存在误差，且不适用于高通量检测。
3．基因芯片技术：
采用原位合成，将DNA探针固定化于支持物表面，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、高效的检测。基于该方法的商品化试剂盒已被广泛用于临床上分枝杆菌的菌种鉴定，能在较短时间内鉴定出MTBC和常见的NTM。
4．线性探针技术：
将PCR扩增、反向杂交、膜显色技术合为一体，通过引物扩增目的片段，扩增产物与膜上固定的特异性探针杂交，通过膜显色反应判断结果。商品化的试剂盒GenoType CM/AS(德国Hain Lifesciences公司)被多项研究用于NTM的鉴定，但其鉴定的菌种有限且鉴定能力有待提高。
5．多重PCR：
近年来，基于多重PCR技术的分枝杆菌菌种鉴定方法的研究较多，但不同研究鉴定的菌种及鉴定能力差别较大。Li等将基于多重PCR的靶向测序技术与生物信息学分析相结合，开发了一个新平台(GenSeizer)，可用于鉴定10种常见分枝杆菌，检测下限能达到5个DNA拷贝或50集落形成单位(colony forming unit，CFU)/mL。Xu等将多重实时荧光PCR与多色解链曲线分析相结合建立了MeltPro Myco分析法，可准确鉴定出51种分枝杆菌参考菌株至种/属水平，并且与16种非分枝杆菌菌种无交叉反应。
6．DNA测序：
目前，最常用的分枝杆菌菌种鉴定序列为16S rRNA基因，可对大部分NTM菌种水平进行鉴定。但某些分枝杆菌种属间16S rRNA多态性相对较低，因此无法区分一些种间序列高度同源的菌种，如鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌与龟分枝杆菌。多种分子标识的联合使用(如ITS、hsp65和rpoB基因等)，可提高对分枝杆菌菌种的鉴别能力。迄今为止，对某一特异性基因扩增片段直接测序的技术仍是分枝杆菌菌种鉴定的金标准。以Roche 454 (Genome Sequencer FLX System，瑞士)和Illumina Miseq/Hise(美国)平台为代表的宏基因组学第二代测序(以下简称二代测序)技术的发展，提高了测序速度，降低了成本，二代测序在各类病原体的临床诊疗中也发挥重要作用，包括结核病的诊断。但是，由于MTB核酸提取过程中破壁困难，二代测序对MTB的检测效能相较于其他普通病原体会降低，需设置特定的序列数阈值。
7．成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)技术：
研究显示，基于CRISPR技术的分枝杆菌鉴定技术具有高灵敏度、准确、快速的优点，其在MTB的诊断及分枝杆菌菌种鉴定中显示出较大的应用潜力。
(四)以生物标志物为基础的检测
基于生物标志物的结核病检测方法多用于结核病的即时诊断。侧流尿脂阿拉伯甘露聚糖测定(lateral flow lipoarabinomannan assay，LF-LAM)可提供结核病的及时诊断，并有助于降低HIV感染者的结核病病死率。WHO自2015年以来一直建议使用该测试，并于2019年发布了政策更新。WHO所推荐的Liu等基于MTB特异性肽片段开发的快速量化血清浓度方法——NanoDisk-MS，使用抗体标记和与纳米颗粒(NanoDisk)结合，并通过MALDI-TOF-MS检测来快速诊断活动性结核。研究证实，NanoDisk-MS有望作为一种准确、快速、定量的基于血液的生物标志物检测方法，可区分成人活动性结核病和非结核病，灵敏度和特异度分别为88.3%和95.8%，在儿童结核病的检测中具有85.5%的灵敏度。
除了上述提到的这些分子生物学技术外，还有环介导等温扩增技术、RNA恒温扩增技术、单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism，SSCP)、单细胞拉曼等。
二、MTB药物敏感性检测方法的进展
(一)表型药物敏感试验
表型药物敏感试验是MTB药物敏感性检测的金标准。常见的MTB药物敏感性表型检测方法包括液体药物敏感试验(BACTEC™ MGIT™ 960法)、比例法(固体)药物敏感试验、绝对浓度法(固体)药物敏感试验、最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)法等。固体药物敏感试验简单、经济，易于推广，但耗时较久，操作复杂，可重复性差。美国食品药品监督管理局在2002年批准BACTEC™ MGIT™ 960法用于MTB对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的药物敏感试验，其在阳性检出率和培养时间上具有明显优势，缩短了报告时间。Sensititre™ MYCOTBI plate (美国Thermo Fisher Scientific有限公司)是近年来出现的新型MTB表型药物敏感性检测商品化试剂盒，其方法相对经济，药物种类较多，但其未经过系统性的临床评价。
(二)分子药物敏感试验
伴随着MTB耐药分子机制研究的深入，通过检测耐药基因突变来快速诊断耐药结核病的分子诊断技术受到越来越多的关注。分子诊断可大幅提高检测效率，但不同试剂盒的诊断效能、覆盖的抗结核药物，以及相应的耐药基因位点存在一定差异。以下简要介绍几种常见的分子药物敏感性检测试剂。
1．GeneXpert MTB/RIF：
GeneXpert MTB/RIF和第2代试剂Xpert MTB/RIF Ultra均可检测利福平的分子药物敏感性，且两者的检测性能相似。数据显示，Xpert MTB/RIF Ultra检测利福平敏感性的灵敏度和特异度分别为92.7%(95%CI 80.1%~98.5%)和98.0%(95%CI 92.8%~99.9%)，而GeneXpert MTB/RIF分别为92.7%(95%CI 80.1%~98.5%)和99.0%(95%CI 94.4%~100%)。Xpert MTB/XDR(美国赛沛公司)采用10色荧光通道的多重PCR技术，可同时检测异烟肼、氟喹诺酮、二线注射类药物，以及乙硫异烟胺相关的耐药基因突变。研究显示，除乙硫异烟胺外，与测序相比，Xpert MTB/XDR检测其他药物敏感性的灵敏度在94%~100%之间，特异度能达到100%，显示出较好的检测性能。
2．线性探针技术：
研究显示与培养相比，使用GenoType MTBDRsl检测氧氟沙星、阿米卡星和广泛耐药结核的灵敏度分别为90.7%、100%和92.3%，特异度分别为98.1%、99.4%和99.6%，且减少了93.3%的标本周转时间。该方法的检测性能较好，但对实验室环境和操作人员的要求较高，不适用于大规模检测。
3．高分辨解链曲线分析(high-resolution melting curve analysis，HRM)：
HRM技术是将实时荧光PCR技术与解链曲线分析技术相结合，其主要原理为基因突变会导致相应的解链温度(Tm值)变化，Tm值的变化幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关，从而可区分野生型和突变型。目前，国内已有基于该技术的MTB利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素和氟喹诺酮类的耐药突变试剂盒，且临床应用显示其检测利福平、异烟肼、氧氟沙星、阿米卡星和卡那霉素敏感性的灵敏度分别为94.2%、84.9%、83.3%、75.0%和63.5%。总体而言，该技术较为方便、快捷，检测时间短，且有自动判读结果的软件，因此较适用于临床推广。
(三)核酸MALDI-TOF-MS
Su等建立的基于核酸的MALDI-TOF-MS检测技术，将MALDI-TOF-MS与多重PCR技术相结合，可同时检测MTBC对8种抗结核药物的耐药性突变。该方法通量大，单个反应可检测多个突变，且一次实验可以处理多个样本，在MTB分子耐药检测方面具有较大的应用前景。
(四)测序技术
全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)可获得详细的细菌耐药基因突变，可预测MTB的耐药表型，且能提供不同菌株间的进化关系等信息。因此，WGS已成为一种有效的预测MTB药物敏感信息的工具。研究人员收集了来自6大洲16个国家的10 290株MTB临床分离株及全基因组序列信息和4种一线抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)的表型药物敏感信息。以表型药物敏感结果为金标准，结果显示WGS预测异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺耐药性的灵敏度分别为97.1%、97.5%、94.6%和91.3%，特异度分别为99.0%、98.8%、93.6%和96.8%。且有研究显示可从临床样本中直接进行MTB的WGS，缩短了获得药物敏感结果的时间，但临床样本直接测序的关键影响因素之一是DNA的提取效率和测序的深度，与培养物测序相比，其技术要求更高。测序技术的结果较为可靠，但其缺乏标准化操作程序，以及共识性的数据分析和解释方法，且测序仪器较为昂贵，因此该技术目前在临床上的使用仍然受限。但随着测序技术生物信息学分析技术的发展，其在MTB实验室诊断中的应用会更广泛。
三、结核病免疫学诊断方法的进展
(一)γ干扰素释放试验(interferon gamma release assay, IGRA)
IGRA是主要通过检测特异性γ干扰素的释放来辅助诊断结核病或判定机体是否感染MTB的体外诊断方法。近期一项荟萃分析评估了IGRA和结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)对潜伏感染向活动性结核病进展的预测价值，结果显示IGRA具有更好的预测能力，且IGRA阳性的个体可能会从预防性治疗中受益，但TST呈阳性的个体可能不会。双重测试可能会改善检测效果，但需要进一步确认。综合评价，TST操作简单、经济，但其特异性差，与很多NTM在抗原性上有交叉，假阳性较高。而IGRA的特异性高，较少受NTM影响，其阳性结果对结核病的诊断具有一定意义；且阴性结果排除结核病的可能性大。IGRA的缺陷为堪萨斯分枝杆菌、斯氏分枝杆菌和戈登分枝杆菌感染易出现假阳性结果。同时，其灵敏度还有待提高，尤其是在儿童和HIV感染者等免疫缺陷人群中。二代IGRA试剂的灵敏度有所提高。二代IGRA试剂分为2种，第1种的抗原为早期分泌抗原靶-6(early secretory antigenic target-6，ESAT-6)、培养滤液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP-10)和Rv3615c，第2种抗原为CFP-10、Rv3615c和Rv3879c，二代IGRA对经培养证实的结核病的灵敏度为94.0%(95%CI 90.0%~96.4%)，对所有结核病(包括培养确诊的病例和高度怀疑结核病)的灵敏度为89.2%(95%CI 85.2%~92.2%)，高于T-SPOT.TB的81.4%(95%CI 76.6%~85.3%)和QuantiFERON-TB的67.3%(95%CI 62.0%~72.1%)。QuantiFERON-TB Gold PLUS是QuantiFERON-TB测定的新版本，除CD4+T淋巴细胞外，它还包含1个额外的抗原管以引发CD8+T淋巴细胞反应。研究显示其可初步区别活动性与潜伏感染，与治疗效果相关。未来IGRA的发展需考虑以下几项：要增加预测潜伏性结核到活动性结核的能力；增加新抗原以提高灵敏性，如Rv3873、Rv3879和Rv3615等；增加更多细胞因子的检测，如γ干扰素诱导蛋白-10(interferon γ-inducible protein-10，IP-10)、单核细胞趋化蛋白-2(monocyte chemoattractant protein-2, MCP-2)、γ干扰素诱导的单核因子(monokine induced by γ-interferon, MIG)等。
(二)免疫标志物
用ESAT-6/CFP-10多肽刺激后，CD38+CD27-CD4+T淋巴细胞分泌的TNF-α具有较好的诊断准确性，区分活动性结核和未感染人群的特异度和灵敏度分别为96.67%和88.86%。Yang等鉴定了结核病的8种蛋白质生物标志物，包括人干扰素诱导T细胞α亚族(interferon-inducible T cell alpha chemokine, I-TAC)、I-309(或CCL1/TCA3)、MIG、颗粒溶素、成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)、含糖基磷脂酰肌醇锚定的MAM结构域(MAM domain containing glycosylphosphatidylinositol anchor, MEP1B)、弗林蛋白酶、淋巴管内皮透明质酸受体-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1, LYVE-1)的诊断价值，这8种生物标志物在训练队列中具有100%(95%CI 98%~100%)的特异度和100%(95%CI 96%~100%)的灵敏度。在测试队列中，特异度和灵敏度分别为83%(95%CI 71%~91%)和76%(95%CI 56%~90%)。在预测队列中，特异度为84%(95%CI 74%~92%)，灵敏度为75%(95%CI 57%~89%)。美国亚特兰大大都会地区一项观察性研究显示，与潜伏性感染相比，活动性结核患者中MTB特异性IFN-γ+CD4+T淋巴细胞表达免疫激活标志物CD38和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)，以及细胞内增殖标志物Ki-67的频率明显更高。CD38+IFN-γ+、HLA-DR+IFN-γ+和Ki-67+IFN-γ+可准确地对活动性结核和潜伏性结核进行分类，具有100%的特异度和大于96%的灵敏度。这些标志物还区分了未经抗结核治疗与成功完成抗结核治疗的活动性结核，并与治疗期间分枝杆菌负荷的降低相关。
四、各种组学用于结核病诊断的进展
当前结核病实验室诊断面临的主要挑战有，区别潜伏感染和活动性结核的诊断技术缺乏，难以预测哪些潜伏感染者将来可能发展为活动性结核，以及缺乏监测结核病治疗的有效指标。近年来，各种组学的发展在这些方面都取得了一定进展，具有较好的临床应用前景，成为研究热点。
(一)转录组学
近期一项前瞻性、多中心队列研究纳入628名参与者进行转录组学分析，并随访6~12个月，整个队列中表现最佳的组合诊断活动性结核的灵敏度为77%(95%CI 66%~87%)，特异度为84%(95%CI 74%~91%)；对于检测高度可能的结核病，最佳的新组合的灵敏度和特异度分别为77%(95%CI 56%~94%)和77%(95%CI 57%~95%)。该研究的最终结论为在低发病率地区具有临床代表性的队列研究中，转录组特征在诊断结核病方面无足够准确性。这些发现表明，转录组学特征对可疑结核病的诊断评估几乎无临床效用。笔者认为，转录组学在结核病诊断中的应用价值尚未明确，还需要在不同人群中进行更多临床研究。
(二)蛋白质组学
有研究者采用非标记定量蛋白质组学鉴定区分肺结核和潜伏感染的新型血浆生物标志物，建立了由α-1-抗胰凝乳蛋白酶(alpha-1-antichymotrypsin，ACT)、α-1-酸性糖蛋白1(alpha-1-acid glycoprotein 1，AGP1)和上皮钙黏素(E-cadherin)组成的诊断模型，区分潜伏性感染和肺结核的灵敏度和特异度分别为81.2%和95.2%，区分健康对照者和肺结核患者的灵敏度和特异度分别为81.2%和90.1%。也有研究显示，AGP1、血清类黏蛋白2(orosomucoid 2，ORM2)和补体成分9(complement component 9，C9)的组合区分结核性积液和恶性积液的灵敏度为73.0%，特异度为89.4%。
(三)代谢组学
使用非靶向质谱技术对结核病患者的血浆进行代谢组学分析，显示4种代谢物12(R)-HETE、神经酰胺(d18：1/16：0)、硫酸胆固醇和4α-甲酸基-4β-甲(烷)基-5α-胆甾-8-烯-3β-醇区分结核病患者和无活动性对照者的灵敏度分别为84.8%、84.8%、87.0%和89.1%，特异度分别为90.0%、86.7%、86.7%和80.0%，可见这些新型代谢标志物特别是12(R)-HETE和4α-甲酸基-4β-甲(烷)基-5α-胆甾-8-烯-3β-醇单独或组合使用，可能对结核病的快速诊断有一定临床价值。
五、结核病实验室诊断新技术应用的前景展望
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