Nature Comm.：宏蛋白组学揭示在高固含量下厌氧微生物群落分解木质纤维素的酶策略
背景介绍
木质纤维素的分解通常涉及几十种具有不同功能和结构的蛋白质。不同微生物群落的产物表达具有多样性，如存在于厌氧消化系统中的微生物群落对有机物和碳水化合物活性酶(CAZymes)的表达。近十年来，研究人员已经利用新兴的组学技术(如宏基因组学、宏蛋白质组学和宏转录组学)对分解木质纤维素的微生物群落的组成和功能特征进行了研究。这些技术已对来自200多个基因组的多达一百万个蛋白质编码序列和上万个CAZymes编码的基因和转录产物进行了研究，并对一千多种微生物群落进行了分析。
宏蛋白组学可用于测量细胞内和细胞外酶机制的物理存在、丰度和位置，以及它们在不同条件下的差异。同时，宏蛋白质组学可为宏基因组学及宏转录组学提供补充信息，但目前还没有关于在高固含量下厌氧微生物群落分解木质纤维素的报道。基于此，美国田纳西州橡树岭国家实验室生物能源创新中心Robert L. Hettich和Lee R. Lynd团队采用基于液相色谱-二级质谱联用(LC-MS/MS)的元蛋白组学方法，对工业过程中在高柳枝稷固含量下厌氧微生物群落对木质纤维素的分解机制进行了研究，并对木质纤维素的溶解性能、不同级分中CAZymes丰度的变化以及甲烷的生成途径进行了阐释。
图文解读
Fig. 1A对实验过程进行了表述。简言之，通过半连续地向厌氧微生物群落中逐步添加柳枝稷，以增加样系统中的固含量，随后对系统进行碳水化合物溶解和宏蛋白组学分析。宏蛋白组学分析通过两种方式进行：(1)全组分分析(1D LC-MS/MS)和组分分离[通过离心将每个样品分为上清液(SNT)、浮游细胞(PC)和底物结合(SB)部分]；(2)多维(2D LC-MS/MS)分析。研究发现，在稳定状态下溶解的碳水化合物的比例(通过葡萄糖、木糖和阿拉伯糖部分的损失来量化)相对恒定，约为66.8%，且与柳枝稷的固含量无关(在30-150 g/L范围内)。碳水化合物溶解速率与固含量成比例增加(Fig. 1B)。此外，观察到的主要分解产物为甲烷(48.7-49.9%)和二氧化碳(47.2-49.0%)，而稳态时未检测到挥发性脂肪酸(VFA)和氢气。随固含量的增加，体积气体产量和甲烷产量对应成比例升高(Fig. 1C)，表明微生物群落分解产物的形成在高达150 g/L的固含量下并未受到影响。
Fig. 1. An anaerobic thermophilic microbiome exhibits undiminished fractional carbohydrate solubilization with increasing solids loadings between 30 and 150 g/L.
随后，作者对三个级分(SNT、PC和SB)中的CAZymes及其与柳枝稷固含量的关系进行了分析(Fig. 2)。不同级分中的CAZymes差异显著，只有75种CAZymes(约14%)同时存在于三个级分中，而大量的CAZymes仅单独存在于PC和SB中(Fig. 2A)，这些差异表明了微生物群落中不同酶的分布以及测量空间分布的重要性。如Fig. 2B所示，绿弯菌门的CAZymes普遍存在于PC级分中，而热袍菌门的CAZymes则主要存在于SNT和SB级分中，表明功能性小生境的存在。从功能的角度来看，糖苷水解酶(GHs)形成的CAZyme种类数量最多，且不受级分影响；其他CAZyme种类，如多糖裂解酶(PLs)、碳水化合物酯酶(CEs)和糖基转移酶(GTs)则在底物或细胞相关的级分中占主导地位；而辅助氧化还原酶(AAs)大多出现在细胞外级分中，并基于细胞位置进一步指示酶活性的富集(Fig. 2B)。
Fig. 2C从定量的角度揭示了三个级分中随柳枝稷固含量增加CAZyme种类丰度的变化。发现AAs数量最少，但随着固含量的增加，在所有级分中的丰度均显著增加。在较高固含量(120和150 g/L)下，SNT中PLs和CEs的丰度均显著下降，但在PC和SB中显示出相反的趋势。在低固含量下，SNT和SB中PLs的丰度大致相似，表明这些酶可能在低固含量时过表达，但仅在有更多结合区域时才与含较高固含量的底物部分结合。
此外，作者还对各个级分中的三种AAs进行了研究(Fig. 4A)。其中，AA2(过氧化物酶)和AA3(葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶)仅在相对低丰度的PC级分中被观察到。AA2的丰度随固含量的增加而降低。AA3的丰度比AA2低一个数量级，且仅存在于较高的固含量中。相比之下，AA6丰度比AA2高1-2个数量级，且在较高的固含量中丰度显著增加(在150 g/L，SNT中增加了约23倍)，并在三个级分中均观察到一致的趋势(Fig. 4A，B)。
Fig. 2. Overview of the measured CAZymes’ repertoire in the three fractions.
AA6的的作用是作为1，4-苯醌还原酶，催化NADPH介导的对苯醌转化为氢醌(Fig. 4C)。虽然柳枝稷并未进行预处理，但对苯醌作为一种预处理和木质素衍生的生长/酶抑制剂，难以去除，表明AA6样酶可能参与生物质水解产物毒性的去除。作者认为，微生物群落可能遵循与褐腐菌相似的途径，即通过产生芬顿试剂以促进柳枝稷的溶解。此外，氧化应激的标志如超氧化物歧化酶(SOD2)和超氧化物还原酶(SOR)也存在于样品中，随级分中(SOD2存在于所有级分中，SOR仅存在于SB级分中)柳枝稷固含量的增加，两者的丰度均显著增加(Fig. 4C，D)。上述结果表明，AA6可能参与芬顿试剂的产生以及木质素屏障的裂解，以增加木质纤维素被CAZymes攻击的可及性。
Fig. 4. The abundance of bacterial AA6 proteins as a function of higher solids loadings.
总结与展望
作者利用宏蛋白组学方法对在不同柳枝稷固含量条件下厌氧微生物群落对木质纤维素的分解能力进行了研究，发现在30-150 g/L范围内，碳水化合物溶解速率与固含量成比例升高。宏蛋白组学分析揭示了不同级分中CAZymes丰度的显著增加。AA6在较高柳枝稷固含量下的显著富集表明了芬顿反应的发生。该项研究为天然微生物群落在高固含量下有效分解利用木质纤维素的机制提供了参考，为生物质高效转化提供了新思路。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-31433-x
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