ACS Sustainable Chem. Eng. | 乙醇、四氢呋喃和γ-戊内酯预处理对提取转基因柳枝稷有机溶剂木质素的影响
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背景简介
由于植物细胞壁复杂的物理化学结构，木质纤维素生物质的顽固性是生物质精炼体系的一个挑战。预处理和基因修饰是生物质转化中的两种方法，可以成功地改性木质纤维素的结构，使其能够更好地进行酶解。然而，通过预处理从转基因柳枝稷中分离得到的木质素之间的结构差异尚未得到广泛研究。
基于此，田纳西大学的Yunqiao Pu和Arthur J. Ragauskas教授采用乙醇（EtOH）、四氢呋喃（THF）和γ-戊内酯（GVL）三种有机溶剂预处理体系对野生型（WT）和两种转基因柳枝稷（COMT和MYB）进行预处理。研究发现所有有机溶剂预处理都使木质素的分子量显著降低，经乙醇预处理的木质素比未经处理的木质素的分子量降低了90%。结果表明，野生柳枝稷和转基因柳枝稷在不同的有机溶剂处理后，可溶性木质素的结构发生了变化。
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图文解读
Molecular Mass Determination
作者通过GPC对三种不同预处理后得到的木质素和未处理的三种柳枝稷纤维素酶解木质素（CEL）进行了分子量检测。Fig. 1展示了其重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）和多分散性指数（D）结果。WT CEL的Mw约为15000 g/mol，比转基因木质素的分子量（COMT CEL为9000 g/mol, MYB CEL为11000 g/mol）高30% ~ 60%。由于木质素解聚，三种预处理得到的木质素的重均分子量均显著降低。WT、COMT和MYB经过EtOH预处理得到的木质素的重均分子量均降低了90%。在三种有机溶剂预处理中，EtOH预处理得到的木质素的重均分子量下降幅度最大，这可能与其预处理温度高、持续时间长有关。WT经过GVL和THF预处理得到的木质素，虽然在GVL/水和THF/水体系中预处理的时间和温度不同，但是其重均分子量相近。对于COMT和MYB柳枝稷，GVL/水体系能有效解聚木质素，重均分子量降低50%左右。而经过THF/水预处理后，COMT和MYB木质素的重均分子量分别仅降低了24%和38%。此外，多分散性结果表明，预处理得到的木质素样品具有低的多分散性，具有广阔的应用前景。
Fig. 1. Molecular mass and dispersity index (D) of the CEL, EtOH, THF, and GVL lignins from WT, COMT, and MYB switchgrass.
HSQC NMR Analysis of Lignin
CEL、EtOH、THF和GVL预处理WT柳枝稷得到的木质素的HSQC光谱如Fig. 2所示。芳香族区域的HSQC光谱表明，所有木质素均由紫丁香基（S）、愈创木基（G）和对羟基苯基（H）结构单元构成。三种预处理得到的木质素样品中均出现了缩合的S单元，而缩合的G单元只出现在EtOH和GVL预处理得到的木质素中。这可能是由于THF预处理的温度低于EtOH预处理温度，持续时间比GVL预处理持续时间短。
在脂肪族区域，柳枝稷木质素出现的最主要的信号是甲氧基和β-O-4键。此外，木质素大分子中还存在β-β树脂醇和β-5连接键。在三种预处理中都观察到木质素中β-O-4键含量的降低，该键的断裂是木质素在有机溶剂预处理中降解的主要机理。因为EtOH预处理温度较高，导致β-O-4键的含量急剧下降。COMT和MYB经过EtOH预处理得到的木质素几乎断裂了全部的β-O-4键，形成了高度缩合的结构，芳香环通过C-C键共价连接。此外，未缩合的经过THF预处理得到的木质素，在生物质分馏过程中有超过50%的β-O-4键保留下来，可以在后续应用中用于木质素解聚生成单体。
Fig. 2. 2D 1H−13C HSQC correlation spectrum of CEL, EtOH, THF, and GVL lignins from WT switchgrass.
31P NMR Analysis of Lignin
31P NMR测定得到的柳枝稷木质素中羟基的含量如Fig. 3所示。由于木质素样品的31P NMR谱均存在S/G/H结构，因此证实了WT、COMT和MYB柳枝稷木质素属于对羟基苯基-愈创木基-紫丁香基型木质素。在有机溶剂预处理过程中，酸催化脱木质素主要是通过β-O-4醚键的断裂，释放出一个游离的酚羟基。因此，酚羟基的相对含量可作为木质素解聚程度的指标。在所有的CEL木质素样品中，游离羟基以脂肪族羟基为主，其含量超过总游离羟基的83%。经过预处理后的木质素酚羟基含量均有所增加，其中COMT和MYB经过EtOH预处理得到的木质素最为显著。COMT和MYB经过EtOH预处理得到的木质素中游离酚羟基的含量极高，表明在EtOH预处理过程中β-O-4键被有效断裂。EtOH预处理得到的木质素中大量的游离酚羟基使其适合应用于木质素的改性和抗氧化方面。THF/水预处理得到的木质素均进行了轻度解聚，具有较高的分子量和较高的脂肪族羟基含量，这与GPC结果一致。
Fig. 3. (a) Hydroxyl content and (b) phenolic hydroxyl group of CEL, EtOH, THF, and GVL lignins from WT, COMT, and MYB switchgrass.
MD Simulations
为了解不同预处理条件下木质素溶解性的变化趋势，作者采用分子动力学模拟（MD）法研究了预处理过程中木质素的结构及其与溶剂之间的相互作用。作者使用CEL木质素模拟未处理生物质中发现的天然木质素。作者对三种不同类型柳枝稷品种进行了研究，计算得到的每个木质素分子与有机溶剂的氢键平均数量顺序为：EtOH≫GVL>THF（Fig. 4）。对于任何给定的柳枝稷类型，这一结果反映了预处理后木质素的平均相对分子质量下降。EtOH是一种质子极性溶剂，既可以作为氢键供体又可以作为氢键受体，而GVL和THF是非质子极性溶剂，只能作为氢受体参与。GVL中的R-C=O/R-O-R键和THF中的R-O-R键均可作为氢受体。作者推测由于GVL中额外的R-C=O氧的存在，GVL可以作为更好的氢受体，这解释了与THF体系相比GVL体系中氢键数量更高的原因。
Fig. 4. (a) Number of hydrogen bonds between the enzymatically extracted lignin molecules (CEL) and the organic solvent alone for three different switchgrass varieties, viz., WT, COMT, and MYB.
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总结与展望
本研究探索了先进的有机溶剂预处理技术，在酸性条件下通过EtOH、GVL和THF预处理野生型（WT）和两种转基因柳枝稷（COMT和MYB）。结果表明，与野生柳枝稷相比，转基因柳枝稷木质素的分子量较低并且具有较低的S/G比。此外，与EtOH和GVL预处理相比，THF预处理转基因柳枝稷获得的木质素的分子量、β-O-4键和脂肪族羟基含量更高。相反，EtOH预处理由于其条件苛刻导致Mw降低90%，β-O-4键几乎完全消除。此外，通过分子动力学模拟计算发现实验中木质素分子的分子量降低与它和有机溶剂之间的氢键数目存在相关性，表明木质素的解聚与它和有机溶剂形成氢键的能力之间存在关联。
原文链接：
https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.2c00948
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